核酸檢測(cè)室氣溶膠產(chǎn)生及預(yù)防

    核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是微觀的，基于細(xì)胞，分子，蛋白水平，而這些微觀樣本對(duì)外界環(huán)境的影響敏感，比如溫度、ph值、酶解、損傷等，在我們盡力呵護(hù)樣本的生存環(huán)境的同時(shí)，污染也是需要注意的頭等大事，要堅(jiān)決避免環(huán)境中的“雜質(zhì)”的亂入，包括樣本污染，試劑儀器交叉污染、產(chǎn)物氣溶膠污染等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。“易查不易察”，污染來(lái)的悄無(wú)聲息，防不勝防，假陽(yáng)性結(jié)果讓無(wú)數(shù)核酸檢測(cè)人員抓狂和崩潰。
   一旦出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染，比如樣本之間交叉污染、試劑污染、儀器污染、陽(yáng)性對(duì)照污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染、氣溶膠污染等，其中氣溶膠污染是一個(gè)非常重要而被忽視的污染源。實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)氣溶膠污染，需要較長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)行*。
 
一、氣溶膠污染原因
1、樣本之間交叉污染。
標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染；標(biāo)本存放運(yùn)輸時(shí)，由于密封不嚴(yán)或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；核酸模板在提取過(guò)程中，由于加樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；手動(dòng)提取核酸樣本時(shí)，污染的手套觸摸離心管內(nèi)蓋導(dǎo)致的污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。
2、PCR試劑污染
PCR試劑在配制過(guò)程中，移液槍、槍頭、離心管等原因造成試劑被PCR核酸模板污染。
3、不同工作區(qū)域移液槍等耗材交叉使用。
 將易污染區(qū)域的移液槍、槍頭、離心管等耗材拿到潔凈區(qū)使用引起的污染；
4、離心機(jī)轉(zhuǎn)子未定期擦拭。
離心機(jī)通常進(jìn)行各種試劑組分、不同盲樣的離心，如果離心管外部沾染病毒、陽(yáng)性核酸或陽(yáng)性質(zhì)粒，容易造成污染。
5、陽(yáng)性對(duì)照造成的污染。
開(kāi)蓋時(shí)間過(guò)長(zhǎng)高濃度質(zhì)粒揮發(fā)到室內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照組分未使用完任意丟棄，加完陽(yáng)性對(duì)照的槍頭未放入消毒液中。
6、擴(kuò)增產(chǎn)物開(kāi)蓋造成的污染。
這是PCR試驗(yàn)中主要、常見(jiàn)的污染原因。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)拷貝的極限，PCR產(chǎn)物開(kāi)蓋后，極易迅速造成擴(kuò)散，極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽(yáng)性。
7、各個(gè)實(shí)驗(yàn)室擦桌布、掃把，簸箕，工作服交叉使用。
 
二、核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室如何預(yù)防污染
1、合理的實(shí)驗(yàn)分區(qū)
原則上可以設(shè)置3個(gè)獨(dú)立的工作區(qū)域：
試劑耗材儲(chǔ)存與準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理和標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)（核酸純化）、擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)，各區(qū)域空間*相互獨(dú)立，不能直接相通。其中試劑耗材儲(chǔ)存與準(zhǔn)備區(qū)必須獨(dú)立設(shè)置。
實(shí)驗(yàn)室實(shí)施空氣流向控制，擴(kuò)增前和擴(kuò)增后區(qū)域應(yīng)具有獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)，擴(kuò)增后區(qū)域保持負(fù)壓狀態(tài)，其它區(qū)域保持正壓狀態(tài)，防止擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域。
 
2、實(shí)驗(yàn)操作流程：
（1）樣品制備區(qū)進(jìn)行樣品處理，核酸提取；
（2）配液區(qū)配置反應(yīng)體系：酶混合液和PCR反應(yīng)液混合，分裝至PCR反應(yīng)管；
（3）樣品制備區(qū)加樣：樣品核酸和陰陽(yáng)性對(duì)照加至反應(yīng)液中；
（4）PCR擴(kuò)增區(qū)上機(jī)擴(kuò)增檢測(cè)。務(wù)必保持單向操作流程，避免各區(qū)實(shí)驗(yàn)室污染。
3、各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)試驗(yàn)用品專(zhuān)區(qū)
配液區(qū)是潔凈的試驗(yàn)區(qū)域，樣品制備區(qū)的潔凈度稍差， PCR擴(kuò)增區(qū)內(nèi)是易被污染的區(qū)域，各區(qū)之間試驗(yàn)物品專(zhuān)區(qū)，避免因交叉使用造成實(shí)驗(yàn)室污染。
4、試驗(yàn)操作要規(guī)范
    （1）正確使用移液槍?zhuān)ＷC試劑配比和計(jì)量正確，同時(shí)避免液體吸入移液槍口造成污染。
    （2）實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中應(yīng)勤換手套，在進(jìn)出不同區(qū)域或進(jìn)行模板操作后，都應(yīng)及時(shí)更換手套。
    （3）試劑盒各組分在打開(kāi)之前應(yīng)先做瞬時(shí)離心(約10s)，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部，從而減少污染手套或加樣器的機(jī)會(huì)。開(kāi)管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠，造成污染。
    （4）樣本量較多時(shí)，應(yīng)將反應(yīng)液預(yù)混，再分裝至PCR反應(yīng)管，后添加核酸模板，以減少單個(gè)添加操作繁瑣造成的污染。
    （5）每次試驗(yàn)必須設(shè)定陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，讀取結(jié)果時(shí)，在保證陰陽(yáng)性對(duì)照均成立的情況下，判讀樣本結(jié)果才有效。
（6）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，PCR反應(yīng)管?chē)?yán)禁打開(kāi)，及時(shí)放置殺孢子劑消毒液中浸泡。
 
三、解決核酸實(shí)驗(yàn)室污染方法
（1）開(kāi)窗通風(fēng)：如在短時(shí)間內(nèi)要消除實(shí)驗(yàn)室污染，開(kāi)窗通風(fēng)促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣流通，使停留在室內(nèi)的核酸排放到室外。
（2）紫外燈照射：將實(shí)驗(yàn)室內(nèi)好生物安全柜內(nèi)物品平鋪，打開(kāi)離心機(jī)內(nèi)蓋，然后將紫外等打開(kāi)照射12-24小時(shí)，通風(fēng)12小時(shí)以上。
（3）消毒液降解核酸：及時(shí)用諾福過(guò)氧化氫殺孢子劑擦拭操作臺(tái)面和儀器，按照1:10稀釋浸泡試驗(yàn)器具，同時(shí)按照1:3比例稀釋涮洗拖布擦拭地面。
（4）高壓：試驗(yàn)耗材、工作衣等進(jìn)行121℃30分鐘高壓。

（5）使用核酸污染清洗液噴灑室內(nèi)降解核酸。

（6）陽(yáng)性污染特別嚴(yán)重，可以采取干霧過(guò)氧化氫消毒熏蒸實(shí)驗(yàn)室。

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